学术园地肝脏芯片及肝病芯片模型

撰稿：上海交通大医院金倩范建高

肝球体是一种常见的研究肝脏的体外模型，它重建类似于天然的结构和功能的3D肝组织，可诱发肝脏脂肪堆积和胶原沉积。然而，它们通常是静态的，并且在多个细胞类型的架构和结合方面受到限制。为了改进这一点，研究人员利用人体细胞开发了3D模型，包括微流控、微生理平台，称为“肝脏芯片”模型。

一、肝脏芯片

肝脏芯片是一个3D体外肝脏微生理系统，一个微观下模拟肝细胞状态和肝脏动态理化环境的高通量系统，其将非实质细胞（NPC）整合于血管层——由人脐静脉内皮细胞和组织巨噬细胞、枯否细胞组成，与相对肝细胞层——由肝星状细胞（HSC）和肝实质细胞（HepaRG）组成。二者之间通过在灌注通道的入口和出口处添加发光传感器，实时测量耗氧量。体外培养的肝脏细胞表现出明显的分化和结构重组，包括极化，但其功能仅稳定4天。另一个巧妙的设计是多尺度结构层次，使需要长期培养以观察药物清除和区域性生理学研究成为可能。然而，由于缺乏对正常肝脏生理活动至关重要的NPCs，该模型不能充分反映肝细胞功能和极化的生理调节。

超大肝小叶（VLSLL）芯片模型由一个六角形组织培养室的集成网络和一个单独的种子饲喂网络组成，模拟了肝小叶与中央静脉的基础结构。VLSLL芯片拥有胆小管网络，通过微流控内皮样屏障创建生物激发的人工肝窦系统。这两种模型通过模拟内皮层的扩散通道限制肝细胞通过，并保护肝细胞免受压力，同时允许营养物质的扩散。然而，这些非生物内皮样屏障不存在于人体，无法在体内重现验证细胞-细胞相互作用和药物代谢。

另一种通过恒定灌注以维持3D组织培养的装置，将多个流体隔离的生物反应器以多孔板的形式集合成一个阵列，每个生物反应器包含一个支架介质，形成了数以百计的3D微型组织单元。与连续的介质循环共同培养的肝细胞和肝窦内皮细胞形成功能性肝样组织。与静态多孔板类似，该系统中的生物反应器是流体隔离的，不能结合两个或多个单独的组织培养孔。

二、肝病芯片模型

1.代谢相关脂肪性肝病的芯片模型

游离脂肪酸（FFAs）中的油酸（OA）和棕榈酸（PA）可用于诱导原代大鼠肝细胞脂肪变性，其中PA导致的剂量依赖性细胞毒性效应与活性氧（ROS）增加和白蛋白生成减少密切相关。考虑到这一点，代谢相关脂肪性肝病芯片设计一个包含HepG2细胞的中央腔室，该腔室被紧密间隔的平行微通道包围，以模拟内皮细胞。为了使剪切应力最小化，介质流经一个通过微通道连接到中央腔室的单独腔室。实验向培养物中添加OA和PA长达48小时诱导代谢相关脂肪性肝病，通过细胞内甘油三酯蓄积、细胞活力和细胞内活性氧水平来探讨发病机制。

在另一个基于FFA的代谢相关脂肪性肝病模型中，使用12个带有内置泵的生物反应器来控制产生氧梯度的介质的流量来模拟体内条件。装置使用原代人肝细胞，向培养基中添加OA和PA14天，细胞内出现甘油三酯积累、细胞色素PE1（CYP2E1）和CYP7A1等关键基因上调，并产生肝纤维化、肝损伤和炎症相关蛋白。该模型通过显示甘油三酯积累减少，可用于筛选吡格列酮和二甲双胍等药物用于临床治疗。虽然肝细胞通过降低CYP3A4等代谢酶活性，并表达多种脂肪因子，从而对高浓度FFAs作出反应，但它们缺乏代谢相关脂肪性肝病/代谢相关脂肪性肝炎的许多特征，这可能是由于缺乏非实质细胞（NPC）。

为了研究肝脏与其他器官的相互作用以及药物动态反应，多器官平台随之兴起，即将不同器官连接在芯片上。例如，装置由肠侧胶原支架多孔膜隔开的两个腔室组成，Caco-2细胞植入肠腔，HepG2细胞植入肝腔。无血清培养基灌流24小时后，再用含OA和PA的培养基灌流细胞24小时，然后对α-脂肪酸（ALA）、丁酸盐和肿瘤坏死因子（TNF）-α治疗后的肝细胞脂肪变性进行定量。结果发现，ALA降低了芯片和2D培养物甘油三酯积累；丁酸盐通过增强肠屏障功能和减少肝细胞内甘油三酯的积累，减少肝脂肪变性；肿瘤坏死因子-α通过影响肠道诱发肝脂肪变性，但在2D单层培养中没有。

2.酒精性肝病的芯片模型

与单细胞培养相比，肝脏芯片模型具有复杂的细胞外基质和胆管、紧密连接、桥粒、脂质储存等肝结构，并进一步改善了细胞色素P功能和表达。为了研究酒精对肝脏的影响，实验通过灌流和静态环境下对肝细胞/肝星状细胞球体进行酒精诱导损伤，然后对其在常规培养基的恢复能力进行测试。实验发现，较高浓度的酒精作用下的损伤在3天内是不可逆的；而低浓度酒精的共培养球体中，肝细胞功能有一定改善，且肝星状细胞活化明显高于肝细胞。该模型能在体外重现肝星状细胞损伤后重建细胞外基质的能力。

最近，新开发了一种由四个细胞系（HepG2，LX-2，EAhyc和U）组成的3D肝窦芯片，用以研究生理流量下酒精性肝损伤肝非实质细胞的病理生理过程。3D肝窦芯片可以重建酒精性肝损伤，并可研究酒精性肝病发生发展过程中不同类型细胞之间的细胞间对话。

3.药物性肝损的肝脏芯片模型

肝脏芯片通过四个传感器测量氧气、乳酸、葡萄糖和温度，估计中心药物流量，以探讨丙戊酸钠、司他夫定的损伤肝脏的机制。两种药物均由于脂质蓄积而导致剂量依赖性肝损伤。由于缺乏多细胞结构，至今尚不清楚这些装置能否模拟体内药物反应的机制和毒理学终点。

三、结论与展望

体外肝细胞培养经历了从经典单层培养模式到最新的肝脏器官模型的转变，可更精确地从时间和空间上控制细胞-细胞及细胞-基质间相互作用。目前各个商业公司已开发成功多种用于研究肝病进展、促进药物研发及药物毒性试验的肝脏芯片模型，分别适用于不同研究目的的肝脏疾病相关试验，满足客户的个性化需求。然而，当前生物工程仍然处于初级起步阶段，还需要更多的工作来开发代表性模型用以研究肝脂肪变和代谢相关脂肪性肝炎等病理学机制。未来的发展方向可能集中在包含肝脏所有细胞类型的模型设备开发上。此外，对于肝脏模型研究的实时监测而不是终点分析，将更好地了解这些模型设备中的动态变化，以便进一步深入探索疾病相关演变过程和发生机制。随着科学技术的不断改进和完善，肝脏芯片技术有望在基础生物学研究、制药业和肝脏临床医学等领域展现十分广阔的应用前景，从而造福全人类。