肠道菌群与围产医学菌群与新生儿疾病

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菌群与新生儿疾病

余加林

作者单位：医院儿科

人体的生存与微生物（主要包括细菌）密切相关，细菌在机体内是一个庞大的群体，仅消化道就有个细菌（约1.5kg），而人体的实质性细胞仅有个。此外，在人体口腔、食道、皮肤以及生殖道都充斥着大量细菌[1]。肠道菌群（gutmicrobiota）是自然界最为复杂多样的微生态系统之一，包含至少种细菌，超过万个基因，是人类自身基因组所编码基因数的10倍以上[2]。菌群是健康的核心，以肠道菌群为例，其结构以及相应代谢改变，不仅受到人体遗传背景、性别、年龄、免疫系统和肠道运动的影响，还受到饮食中未消化的碳水化合物、脂肪、益生元、益生菌等的影响，也受到抗生素暴露以及肠道手术等的影响。菌群结构和代谢状况会影响机体的生理和病理过程，如脂肪组织的发育过程、葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性、炎症反应、脂肪变性、饱胀感觉以及能量效率等[3]。从刚出生到1岁，婴幼儿肠道菌群的构成就已发生显著的变化，菌群多样性逐渐增加，细菌种类由简单到复杂[4]。新生儿肠道菌群受许多因素的影响：如分娩方式、胎盘及羊水、母亲因素（营养、体重指数、妊娠期体重增长、微生物结构等）、喂养方式以及抗生素暴露等[5]。

一、新生儿呼吸机相关性肺炎（ventilator-associatedpneumonia，VAP）与菌群

本研究组在年首次报道了新生儿VAP患者气管内导管上的细菌不是孤立存在的，而是以群体形式即生物膜（biofilm）形式存在，生物膜是群体细菌形成的菌落组织以及分泌的胞外基质构成的严密组织结构，以逃避机体的免疫反应及抗生素的清除[6-7]。采用变性梯度凝胶电泳技术检测机械通气新生儿气管内导管表面生物膜细菌结构，发现生物膜细菌群落由多种细菌组成，其多样性随气管内导管放置时间延长而下降，发生VAP的危险性增加；T-A克隆后测序发现每个气管内导管表面均有克雷伯菌属存在，且以肺炎克雷伯菌为主，而痰培养仅45%为阳性；77%标本检测出链球菌属（占36%），而痰培养则报告为“正常菌群”[8]，并且由于挑取菌落的随意性及培养基的选择等因素，痰培养结果存在一定的局限性和片面性。随着高通量测序技术的应用，本研究组于年发现呼吸道菌群中链球菌的存在，VAP患儿气管内插管后痰中链球菌比例逐渐增加，到第5天非常明显[9]，进而发现，无论是因为新生儿呼吸窘迫综合征，还是因为感染性肺炎并发呼吸衰竭接受机械通气治疗的患儿，并发VAP者气管内导管表面链球菌检出率均明显高于未发生VAP组[10]。采用16SrRNA聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳和物种特异性聚合酶链反应方法证实，与新生儿VAP发生有关的链球菌多见的菌种，为同属于草绿色链球菌的轻型链球菌（15/20）、口腔链球菌（3/20）、唾液链球菌（1/20）和肺炎链球菌（3/20）[11]。研究表明，轻型链球菌在新生儿口腔中最常见，几乎不具有致病性[12]。但轻型链球菌与VAP代表性致病菌—铜绿假单胞菌共培养，可使后者的生物膜形成及内部菌落数均增加，控制生物膜形成的关键基因和控制生物膜基本成分藻酸盐合成的关键基因的表达也增加[10]。随后本研究组证实，轻型链球菌分泌的自体诱导因子-2（autoinducer-2，AI-2）有控制上述基因的作用，并呈剂量依赖性[13]，加入AI-2类似物D-核糖（ribose）可以逆转这一作用[14]。在接受机械通气治疗且并发VAP的患儿中，菌群中有链球菌与无链球菌的患儿相比，前者从插管到发生VAP的潜伏期更长，肺泡灌洗液中白细胞升高的程度没后者明显；细胞培养也表明，导管生物膜链球菌临床分离株及铜绿假单胞菌混合培养与人肺上皮细胞培养3h，并不引起白细胞介素-8表达升高[10]，提示链球菌的存在可能导致肺部炎症的慢性过程。

二、新生儿坏死性小肠结肠炎与肠道菌群

新生儿坏死性小肠结肠炎（necrotizingenterocolitis，NEC）是新生儿期最常见的胃肠道急症，以早产儿、极低出生体重儿多见，病死率高达20%~40%[15]。美国每年治疗NEC的财政投入达到10亿美元[15]。临床以腹胀、呕吐及便血为主要表现，以肠壁囊样积气和门静脉充气征为X射线特征。病因机制尚不明确，目前认为与以下机制有关：肠道微生物受抗生素暴露等影响后多样性降低、肠道遗传背景如Toll样受体多态性、肠道屏障功能不成熟（如黏液减少、IgA不足、细胞间链接不完整以及通透性增加等），进而激发肠道炎症反应和组织损伤，最终导致多处肠组织坏死[15]。本研究组采用激光捕获显微切割和革兰染色获得因NEC切除的新生儿肠组织，另选取先天性肠闭锁组织作为对照组，通过聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳进行16SrRNA基因检测，发现对照组7例标本中共18个优势条带，共检测到10个菌属；NEC组18例标本中有个优势条带，共检测到16个菌属，对比2组发现，NEC组变形菌门（Proteobacteria）相对丰度明显升高，厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度降低，放线菌门相对丰度未见明显变化[16]。随后经高通量测序对NEC与对照组患儿的粪便和肠灌洗液进行菌群检测，也发现同样的变化。使用KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）数据库预测NEC肠道菌群功能发现脂质代谢降低；肠道菌群代谢组学非靶向测定发现，短链脂肪酸（shortchainfattyacids，SCFAs）中乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸合成降低，而分解代谢未受影响；质谱检测分析也发现新生儿NEC肠内容物与肠闭锁对照组织比较，乙酸和丁酸水平的降低差异有统计学意义[17]。从流行病学研究得知，母乳中的寡糖是SCFAs主要来源之一，因此母乳喂养儿NEC发生率低；因SCFAs主要由厚壁菌门细菌分解寡糖产生，而NEC患儿肠道菌群中厚壁菌门相对丰度减少，所以SCFAs减少，导致炎症调节功能下降而易发生NEC[18]。动物实验证实，SCFAs可以使CD4+细胞中特异性表达转录因子Foxp3+的调节性T细胞（regulatoryTcells，Treg）数量增多，其分泌白细胞介素-10的功能也增加[19-20]。正常情况下，健康的肠道菌群可以产生足够的SCFAs，诱导肠组织中的NaiveT细胞分化为Treg细胞，足够抑制炎症反应。而厚壁菌门细菌不足的肠道菌群不足以产生SCFAs，肠组织中NaiveT细胞则分化为效应T细胞，容易诱发炎症。

三、经验性使用抗生素对肠道菌群的影响

新生儿早发型败血症（early-onsetsepsis，EOS）是指新生儿出生后72h内发病的败血症，多数在生后24h内有表现，但少数患儿刚出生时并无表现，以后很长时间才表现出症状，但此时病情进展快，病死率约26%，是晚发型败血症的2倍。考虑到EOS的隐匿性和危害性，目前普遍使用的筛查检验需要感染后至少4~6h才能反映出来，而抗生素发挥作用时间至少6~8h，待临床有表现时再开始使用抗生素为时已晚，故临床依据新生儿的如下危险因素作出拟诊断，如极早产儿、母亲绒毛膜羊膜炎、部分母亲B族链球菌（GroupBStreptococcus，GBS）定植或感染以及胎膜早破≥18h等，开始经验性使用抗生素；美国EOS指南指出，生后48~72h内必须决定抗生素继续使用还是停止，因经验性抗生素使用时间延长会增加NEC和晚发败血症的发生风险[21]。本课题组将出生后即转入重庆医院治疗的36例早产儿分为生后7d内未用抗生素组、生后使用哌拉西林-他唑巴坦＞7d组（哌拉西林组）和青霉素+拉氧头孢组共3组，采用16SrRNA聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳技术及IlluminaMiSeq高通量测序技术，动态观察不同日龄早产儿粪便标本肠道菌群的变化，结果发现3组日龄3d及5d的粪便标本Shannon指数比较差异无统计学意义；使用抗生素的2组中，日龄7d的粪便样本Shannon指数明显低于对照组，且哌拉西林组和对照组均以克雷伯菌属为优势菌；与对照组比较，哌拉西林组肠球菌属及链球菌属比例明显增加，肠杆菌比例则明显降低；生后使用抗生素会降低早产儿肠道菌群多样性[22]。肠道菌群DNA操作分类单位（operationaltaxonomicunits，OTU）分布的Venn图显示，随着抗生素使用时间延长，3组间共有OTU数量减少；主坐标分析（principalcoordinatesanalysis，PCA）显示，日龄3d时3组的所有粪便标本均呈分散分布，日龄7d时未用抗生素组的10例标本呈聚集状态，而哌拉西林-他唑巴坦组和青霉素+拉氧头孢组组内聚集程度欠佳；从菌群结构门水平上看，最初以变形菌门和厚壁菌门为主，且随日龄和抗生素使用天数增加，未用抗生素组和青霉素+拉氧头孢组变形菌门比例增高，哌拉西林-他唑巴坦组趋势相反；日龄3d肠道菌群属水平上，未用抗生素组菌属分布较均匀，青霉素＋拉氧头孢组乳杆菌属比例较高（31.57%），而哌拉西林-他唑巴坦组以肠球菌属、链球菌属、假单胞菌属为主；抗生素使用7d明显改变肠道菌群的代谢：糖代谢途径、产生链霉菌代谢、甲基丙二酰辅酶A和丙二酰辅酶A脱羧酶缺乏等，减少亚油酸、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、泛酸和柠檬酸的产生，使肠道自然防御屏障减弱[23]。所以临床上对早产儿经验性使用抗生素后，应在排除感染后及时停用，以减轻对肠道菌群的影响。

四、分娩方式对肠道菌群的影响

经阴道分娩是人类繁衍的自然途径，分娩期的生殖道菌群有利于所生婴儿肠道健康菌群的建立，然而剖宫产使婴儿失去了与产道接触的机会，取而代之，首先定植医院环境下经多次抗生素选择压力后存活下来的广泛耐药的致病菌。本课题组研究发现，无论生后2d或者4d，阴道分娩新生儿与剖宫产新生儿肠道菌群分布明显不一致，前者拟杆菌属明显多于后者[24]。有研究显示，NEC患儿肠道中脆弱拟杆菌含量低[25-26]。本研究组最近研究表明，脆弱拟杆菌可刺激肠道CD4+细胞中Treg细胞的分化，增加肠组织白细胞介素-10的分泌，在NEC小鼠模型中发挥保护肠道的作用[27]。剖宫产新生儿肠道菌群中的潜在致病菌明显增加，如葡萄球菌属、链球菌属、肠杆菌属以及梭菌属，而常为人们熟知的益生菌—双歧杆菌属和乳酸杆菌属不足，可导致健康平衡的肠道菌群迟迟不能建立。

此外，菌群不但与新生儿疾病有关，还与新生儿体格生长发育、免疫功能正常发育、神经精神发育、肾脏等许多脏器发育和功能密切相关。菌群作为控制人体生长发育和许多疾病的非常重要的外因，与机体遗传背景这一内因相互作用，是新生儿发育和疾病的机制，对于菌群的深入研究必将对新生儿学科产生深远的影响。

稿件编辑：高雪莲