菊茎叶提取物改善肠功能失调的代谢组学研究

摘要：目的整体评价菊茎叶水提取物（JST）和乙醇提取物（JCT）对肠功能失调的改善作用及其机制。方法应用脂多糖（LPS）制备兔肠功能失调模型，给予JST和JCT，应用1H-NMR技术研究兔粪便内源性代谢物变化规律。结果相比对照组，模型组乳酸盐、甲酸盐显著增加，丙酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸盐、天冬氨酸等显著下降；JST和JCT均能够增加天冬氨酸、腺嘌呤、苯丙氨酸、酪氨酸水平，同时降低甲酸盐水平。结论代谢通路分析表明JST和JCT通过调节LPS所致紊乱的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸盐代谢，以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，发挥改善肠道功能紊乱的作用。

菊花为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序，具有散风清热、平肝明目的功效，用于治疗风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒等症。《神农本草经》将菊花列为上品，现代研究亦证实菊花的低毒性，适宜长期饮用[1-2]。除了作为主要药用部位的花序外，菊茎叶在历代本草中也有大量记载。《本草纲目》称菊“其苗可蔬，叶可啜，花可饵，根实可药”；《本草正义》称其“作枕明目，叶亦明目”；《本草乘雅半偈》称其“久服利血气，轻身耐老延年。茎叶根实并同”。《食疗本草》称菊叶“主头风，目眩，泪出，去烦热，利五脏”；《日华子本草》称其“明目。生熟并可食”。此外，《中药大辞典》和《中华本草》记载菊叶味辛、甘，性平，具有清肝明目、解毒消肿的功效，治疔疮、痈疽、头风、目眩。由此可见，菊根、茎、叶等非药用部位和和菊花序药用部位有类似的功效。

药用菊花在我国分布广泛，类型多样，根据产地的不同，主要分为杭菊、贡菊、亳菊、滁菊、怀菊、济菊和祁菊等，加上长期的相互引种栽培，共形成20余种栽培类型[3]。其中，《中国药典》年版收录了杭菊、贡菊、亳菊和滁菊。菊花的产量及市场需求量巨大：其中江苏亭湖地区菊年产量为t；安徽亳州亳菊、黄山贡菊和滁菊年产量分别为、、t[4]。虽然菊茎叶产量巨大、蕴藏量丰富，但由于化学成分及生物活性研究较少，菊茎叶在菊种植过程中被当作生产垃圾处理，造成巨大的浪费。而菊茎叶产量巨大，远高于花序，是一类蕴藏量十分丰富、亟待开发利用的资源，本课题组对菊花及菊茎叶进行了大量前期研究，表明菊茎叶和花具有共性物质基础，即都含有大量黄酮类和酚酸类成分，且菊叶中黄酮类和酚酸类成分含量略高于花[5]，并得到新加坡国立大学相关研究的证实[6]。如对菊的茎叶加以利用，可能带来良好的经济、社会和生态效益，尤其在当今资源逐渐短缺的前提下，更应加强对药用菊花的非药用部位的资源化利用[7-8]。

据本草记载，菊“疗腰痛来去陶陶，除肠中烦热，安肠胃，利五脏，调四肢”，据此推测菊茎叶可用于调节肠功能紊乱。前期研究表明菊茎叶多糖能够改善2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇导致的大鼠结肠炎和硫酸葡聚糖（DSS）所致小鼠急性溃疡性结肠炎，主要表现为菊茎叶多糖通过降低病原微生物如埃希氏杆菌属Escherichia、肠球菌属Enterococcus细菌的相对丰度，同时增加有益微生物如丁酸梭菌属Butyricicoccus、梭菌属Clostridium和双歧杆菌属Bifidobacteriu等细菌等的相对丰度[9]；同时，菊茎叶多糖能够增加结肠炎大鼠肠道内短链脂肪酸（SCFAs）的含量，改善结肠炎动物肠道菌群的失衡，恢复肠道菌群的代谢功能，从而缓解和改善结肠炎的症状[10]。此外，菊茎叶含有丰富的叶绿素、纤维素、氨基酸和核苷酸类等营养成分，可以作为动物的青储，本课题组已经研究菊茎叶多糖对啮齿类动物肠道炎症的影响，本研究在前期研究基础上选择非啮齿目草食性模式动物新西兰兔为研究对象，拟从粪便代谢组角度揭示菊茎叶乙醇提取物和水提取物对非啮齿目草食性动物肠道功能的影响，使得相关研究更为全面。据此，采用核磁代谢组学技术研究菊茎叶提取物对脂多糖（LPS）所致兔肠道功能紊乱的改善作用，为菊茎叶的资源化利用提供参考和依据。

1材料

1.1仪器

LABCONCOFreeZone冷冻干燥机，美国LABCONCO公司；超纯水系统，美国ThermoFisherScientific公司；核磁共振仪，德国Bruker公司。

1.2药材

菊茎叶样品产自白菊花主产区江苏射阳马镇，由江苏鹤乡菊海现代农业产业园发展有限公司提供，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为菊属杭白菊栽培类型中的红心菊ChrysanthemummorifoliumRamat.cv.hongxinju。

1.3动物

清洁级雄性新西兰兔，体质量1.8～2.0kg，购于南京青龙山实验动物繁育场，合格证号SCXK（苏）-。饲养于人为控制的环境中［湿度（50±5）%，温度（23±1）℃和亮/暗交替（12h/12h）］。本实验与美国国立卫生研究院以及南京中医药大学动物伦理委员会对实验动物照料和使用要求的指导方针一致。

1.4试剂

羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；LPS、三甲基硅基丙酸盐（TSP）购自Sigma化学试剂有限公司；重水（D2O）购自北京海天生物医药科技公司。

2方法

2.1样品制备

菊茎叶适当粉碎，投入提取罐中，注入干药材质量8倍的95%工业乙醇回流提取3次，每次3h，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩至含生药量10g/mL，即得菊茎叶乙醇提取物浸膏（JCT）。向醇提物后药渣中注入干药材质量8倍的水，控制加热温度98～℃，提取3h，停止加热，放出提取液，滤过，减压浓缩至含生药量10g/mL，即得菊茎叶水提取物浸膏（JST）。

前期研究可知，菊茎叶中脂溶性成分主要为黄酮类和酚酸类成分[5]，水溶性成分主要为多糖类成分。分别以芦丁和绿原酸为对照品，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法和福林-酚法测定JCT中总黄酮和总酚酸的含量，可知JCT中总黄酮和总酚酸的质量分数分别为34.52%和29.38%。分别以葡萄糖和葡萄糖醛酸为标准品，采用苯酚-硫酸法和咔唑-硫酸法测定JST中中性多糖和酸性多糖的含量，可知JST中中性多糖和酸性多糖的质量分数分别为41.90%和36.26%。

2.2动物分组及给药

取清洁级兔40只，适应性饲养1周后随机分为4组：对照组、模型组、JCT组、JST组，每组10只。其中JCT和JST组分别ig给药，生药剂量均为20mg/kg（参考菊花的临床剂量5g/d）；对照组和模型组ig空白溶剂（0.5%的CMC-Na溶液），体积与给药组相同。每天1次，连续给药7d。末次给药后1h，除对照组外，其余各组每只兔后脚掌肉垫下scμg/mL的LPS生理盐水悬液0.5mL[11]。注射LPS后24h，耳缘静脉iv2%利多卡因进行麻醉，待其麻醉后剪去腹腔中线附近的毛，酒精棉擦拭，沿腹腔中线切开表面皮肤并逐层打开腹腔，寻找兔大肠，无菌条件下收集于无菌EP管中，迅速保存于?80℃冰箱中备用。

2.3样品前处理

取各组动物粪便1g，加入5mL预冷的乙腈-水溶液（1∶1），研磨匀浆，于4℃以r/min离心10min，收集上清液，利用氮吹仪浓缩，冷冻干燥仪冻干，储存于?80℃以备分析。冻干的粪便提取物用μLD2O配制的磷酸缓冲液（0.2mol/LNa2HPO4/NaH2PO4，pH7.0）复溶。样品涡旋，然后4℃下r/min离心10min，以除去不溶物。取上清液加入50μLD2O配制的TSP溶液（1mg/mL），涡旋混匀，并转移至5mm的核磁管内进行氢谱数据采集[12-13]。

2.4代谢组数据采集

所有图谱均由BrukerAV核磁共振仪进行采集，采用NOESYPR脉冲序列进行图谱采集：弛豫延迟-90°-t1-90°-tm-90°-收集信号-自由感应衰减信号，在循环延迟和NOESY混合时间采用噪声照射方式压制水峰。次的自由感应衰减信号生成32K的数据点，图谱的宽度是10kHz，每次扫描的采集时间是2.54s，循环延迟和混合时间（tm）分别为2s和ms。应用Topspin3.0软件对所有图谱进行自动的相位校正和基线校正，并将TSP的信号校正至0.00[14-15]。

2.5数据处理

去除水峰及其邻近信号（δ4.30～5.45）后，通过R语言编程的程序对所有的图谱进行位移校正。通过PROcess软件包，δ0.70～9.40的区域进行binning操作，采用的自适应binning方法基于文献中在Matlab（version7.3，MathWorks，Natick，MA）实现的代码。上述binning后的数据在进行多变量统计分析之前，先用R软件进行probabilisticquotientnormalized、中心化和paretoscaling处理[16]。

2.6多变量统计分析

多变量统计分析方法采用R语言编程的无监督的主成分分析（PCA）和有监督的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。PCA用来获取不同的代谢表型的总体概观以及去除离散度大的异常值，OPLS-DA则用来减少组别假阳性分离的机率。OPLS-DA将X矩阵（图谱数据）和Y矩阵（模型类别）相关的组别区分变量集中于第一主成分，去除和Y矩阵正交的不相关的变量对模型的影响，从而更有利于模型的解释。通过彩色编码的载荷图筛选显著改变的代谢物，并进一步通过一个网络版代谢组学工具Metaboanalyst（







































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